Para diagnosticar esta enfermedad, el médico mide la absorción de la lactosa por el aparato digestivo mediante la prueba de tolerancia a la lactosa, la prueba del aliento de hidrógeno o la prueba de acidez de las heces.

El niño que va a realizar la prueba debe ir en ayunas. A continuación beberá un líquido con lactosa para la prueba y se le sacarán muestras de sangre en las dos horas siguientes para medir el nivel de glucosa en sangre que indica cómo digiere el organismo la lactosa. El diagnóstico se confirma si el nivel de glucosa en sangre no aumenta. Esta prueba no se realiza a bebés ni a niños muy pequeños por el riesgo de deshidratación al beber el líquido que contiene lactosa, que puede causar diarrea en los que son intolerantes a la lactosa, lo que resulta en deshidratación.

El hidrógeno se detecta en pequeñas cantidades en la respiración, sin embargo, cuando las bacterias fermentan la lactosa no digerida en el colon, se produce mayor cantidad de hidrógeno en el aliento. El hidrógeno se exhala después de ser absorbido por los intestinos y conducido por el flujo sanguíneo hasta los pulmones.

La prueba de acidez de las heces es segura para recién nacidos y niños pequeños. Detecta el ácido láctico y otros ácidos grasos de cadena corta de la lactosa no digerida fermentada por las bacterias en el colon. También se puede detectar la glucosa.