En niños, los síntomas de la enfermedad de Lyme puede imitar a los de otras enfermedades comunes de la infancia y los niños no se dan cuenta de que han sido mordidos por una garrapata, por lo que el diagnóstico de la enfermedad puede ser difícil.

El diagnóstico de la enfermedad de Lyme se basa en la información que proporcionan el paciente y los padres y en el juicio clínico del médico, particularmente  mediante la eliminación de otras posibles causas de los síntomas. El diagnóstico diferencial (distinguir la enfermedad de otras) se basa en la evaluación clínica con exámenes de laboratorio utilizados cuando sea necesario. El enfoque de dos pasos es el que por lo general se utiliza para confirmar los resultados. Debido a la posibilidad de resultados erróneos (falsos positivos y falsos negativos), el diagnóstico no se puede establecer solamente con las pruebas de laboratorio.

En la actualidad se puede realizar una nueva prueba que busca los antígenos (sustancias que estimulan la producción de anticuerpos) producidos por la  bacteria Borrelia burgdorferi, cuyos resultados se conocen en una hora en el consultorio del médico. Un resultado positivo en esta prueba se confirma con un segundo análisis, conocido como inmunoblot, que se realiza en laboratorio.

El médico sabe qué organismos causantes de enfermedades es común en su zona geográfica. La información más útil es si el paciente ha notado la picadura o la erupción y si sucedió a nivel local o estando de viaje. El médico puede no tener en cuenta la enfermedad de Lyme si es rara a nivel local, pero la tendrá en cuenta si el paciente menciona que ha estado de vacaciones en una zona donde la enfermedad es común.