Conocer la ruta completa de una fístula anal es fundamental para un tratamiento eficaz. Generalmente, la apertura externa de la canal se detecta fácilmente, mientras que encontrar el orificio interno puede ser más complicado.

La apertura externa suele aparecer como un área enrojecida e inflamada que puede supurar pus y sangre. A veces, la fístula se puede sentir como un núcleo duro.

A pesar de los esfuerzos, a veces la ruta de la fístula puede no se puede localizar si no es con cirugía.

Para diagnosticar las fístulas anales se utilizan:

• Sonda Fístula: Un instrumento especialmente diseñado para ser insertado a través de una fístula
• Anoscopio: Un pequeño endoscopio (tubo con una cámara diminuta en el extremo) para ver el canal anal

Las herramientas de diagnóstico utilizadas para fístulas más complejas pueden ser:

• Azul de metileno diluido: Se inyecta colorante en la fístula
• Fistulografía: Inyección de una solución de contraste en una fístula seguido de una radiografía de la zona afectada
• Imagen de resonancia magnética: Reservado para las fístulas más difíciles de encontrar
• Ecografía endoscópica

Se puede utilizar una sigmoidoscopia flexible  para descartar otros trastornos como la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn.