Los pacientes con síndrome de Cushing de causa suprarrenal tienen niveles bajos de hormona adrenocorticotropa en sangre, mientras que los pacientes con Síndrome de Cushing debido a otras causas tienen estos niveles normales o elevados.

La mejor prueba para distinguir un tumor productor de hormona adrenocorticotropa en la hipófisis (si este no se ve en las imágenes radiológicas) de uno situado en cualquier otra parte del cuerpo es un procedimiento llamado cateterismo de senos petrosos inferiores. Esto comporta insertar un pequeño tubo de plástico en las venas izquierda y derecha de las ingles (o del cuello) e ir subiendo hasta llegar a las venas cerca de la hipófisis. Se extrae sangre de estas zonas, y también de una vena del brazo.

Durante el proceso se inyecta una medicación que eleva la producción y secreción de hormona adrenocorticotropa de la hipófisis. Se hace el diagnóstico comparando los niveles de hormona adrenocorticotropa alcanzados cerca de la hipófisis en respuesta a la medicación con la concentración alcanzada en una vena periférica (del brazo, por ejemplo).

También se utilizan otras pruebas para el diagnóstico de la enfermedad de Cushing como el test de supresión de la dexametasona o el test de estimulación con CRH (hormona liberadora de la corticotropina). Sin embargo, estos tests no son tan fiables como el cateterismo de senos petrosos inferiores para distinguir entre las posibles causas de la enfermedad. Así, puede que el médico necesite varias pruebas para poder confirmar los resultados.

También existe la posibilidad de visualizar la hipófisis mediante una exploración llamada resonancia magnética. Esto comporta inyectar una sustancia que ayudará a que se vea mejor el tumor en la resonancia. Si se muestra un tumor definido de cierto tamaño y los resultados del test de supresión con dexametasona y de estimulación con CRH son compatibles con la enfermedad de Cushing, puede que no haga falta el cateterismo de senos petrosos inferiores. De todos modos, aproximadamente el 10% de la población sana puede mostrar una imagen anómala en la hipófisis, que podría parecer un tumor. Por lo tanto, la presencia de una zona anómala únicamente no confirma el diagnóstico de enfermedad de Cushing. Además, en aproximadamente el 50% de los casos de enfermedad de Cushing el tumor es demasiado pequeño para ser detectado. Por eso, la ausencia de tumor en la resonancia no excluye necesariamente la enfermedad de Cushing.