El diagnóstico de mononucleosis infecciosa lo plantea el médico al observar la sintomatología producida por la enfermedad. El diagnóstico es confirmado por los análisis de sangre que también pueden incluir pruebas para excluir otras enfermedades con sintomatología similar.

Normalmente se realizará una exploración física al paciente. El médico buscará en particular nódulos linfáticos, alteraciones en las amígdalas, en el hígado o en el bazo así como otros signos propios de la enfermedad. 

En el curso de la mononucleosis infecciosa el análisis de sangre puede mostrar un aumento de un tipo de glóbulos blancos, los linfocitos. Los linfocitos aumentan como consecuencia de la acción del sistema inmunitario por la inflamación que provoca la enfermedad.

Pueden realizarse análisis de sangre específicos y pruebas que demuestren la presencia de anticuerpos para confirmar el diagnóstico de la enfermedad. Se pueden descubrir también alteraciones de los parámetros hepáticos en sangre.