El diagnóstico se realiza mediante el aislamiento de la bacteria Hemophilus ducreyi en una cultura de una úlcera genital o bucal. El chancro se confunde a menudo con síntomas de otras enfermedades de transmisión sexual (ETS) como sífilis o herpes. Por lo tanto, es importante que un profesional de la salud someta al paciente a una serie de pruebas para poder verificar si se padece la enfermedad.

Una tinción de Gram para identificar H. ducreyi es posible, pero puede ser engañoso porque de otros organismos que se encuentran en la mayoría de las úlceras genitales.

Al paciente se le puede someter a muchos test para descartar algunas enfermedades, pero la realidad es que los tratamientos para diagnosticar el cancroide se basan en exámenes físicos relacionados con cuestionarios de hábitos de higiene diaria y cuestionarios de historial familiar de enfermedades que puedan estar relacionadas.