La holoprosencefalia no tiene una causa única, pero la mitad de los casos se asocian con un cariotipo anómalo (un número anormal de cromosomas), especialmente la trisomía 13 (copia extra del cromosoma 13) y la trisomía 15 (copia extra del cromosoma 15). También puede darse en familias como un rasgo autosómico recesivo, dominante, autosómico recesivo o ligado al cromosoma X. En la actualidad, los investigadores creen que la holoprosencefalia podría estar vinculada a un máximo de 12 regiones cromosómicas en 11 cromosomas.

El riesgo aumenta si la madre padece diabetes o tiene una infección durante el embarazo, como sífilis, herpes, citomegalovirus, rubéola o toxoplasmosis. También se ha sugerido el uso de ciertos medicamentos u otras sustancias durante el embarazo (por ejemplo, el alcohol, la aspirina, litio, Thorazine, anticonvulsivantes, hormonas, ácido retinoico) como un factor de riesgo. Las mujeres que han tenido abortos involuntarios anteriores y sangrado en el primer trimestre también son más propensas a tener fetos con holoprosencefalia.